Estudante de arquitetura, na Escola Superior de Belas-Artes de Lisboa, Rui Mendes tornou-se ator profissional em dezembro de 1956, no Teatro do Gerifalto. A peça foi A Ilha do Tesouro, sob a direção de António Manuel do Couto Viana, e foi representada no Teatro da Trindade. Em 1961 abandona arquitetura quase no fim, para cumprir o serviço militar, sendo mobilizado para a Guerra Colonial, em Angola. Quatro anos volvidos, de novo na metrópole, retoma definitivamente a carreira teatral.

Integrará, entre outras companhias (e além do Teatro do Gerifalto), a Empresa Vasco Morgado, o Teatro Popular de Lisboa, Teatro Moderno de Lisboa, Teatro Nacional Popular, Grupo 4/ Teatro Aberto — de que foi um dos fundadores —, Teatro ABC, Teatro Adóque — de que também foi fundador —, Teatro da Cornucópia, Teatro Nacional D. Maria II e Teatro da Malaposta.

Entre muitas interpretações no Teatro, salienta A Tia de Charley (1961), Knack (1967), À espera de Godot (1968), Amanhã digo-te por Música (1969), Saídas da Casca (1971), Insulto ao Público (1972), O Círculo de Giz Caucasiano (1976), O Judeu (1981), Super Silva (1983), A Mulher do Campo (1986), A Escola das Mulheres (1993) e O Magnífico Reitor (2001) e A Vida de Galileu de Bertolt Brecht, que protagonizou em 2006.

Trabalhou com diversos encenadores, como António Manuel Couto Viana, Francisco Ribeiro, Adolfo Gutkin, Costa Ferreira, Fernando Gusmão, João Lourenço, João Mota, Luís Miguel Cintra, Jorge Lavelli, Fernanda Alves e José Peixoto.

A partir de 1975 dedicou-se à encenação, tendo assinado entre outros trabalhos: Três Irmãs de Tchekov (1988 - Teatro da Cornucópia), Sonho de uma Noite de Verão de Shakespeare (1991 - Teatro da Malaposta), Descendentes de Kennedy de Robert Patrick (1992 - Teatro da Malaposta), A Louca de Chaillot de Jean Giraudoux (1995 - Teatro Nacional D. Maria II), Tio Vânia de Tchekov (1998 - Teatro da Malaposta), Picasso e Einstein de Steve Martin (2005 - Teatro da Trindade) e Vermelho Transparente baseado na obra de Jorge Guimarães (2006 - Teatro Nacional D. Maria II).

No cinema participou em cerca de vinte películas, entre elas - Raça, de Augusto Fraga (1961); Dom Roberto, de José Ernesto de Souza (1961); O Meu Nome É..., de Fernando Matos Silva (1978); Nem Pássaro nem Peixe, de Solveig Nordlund (1978); Francisca, de Manoel de Oliveira (1981); Os Abismos da Meia-Noite, de António de Macedo (1983); Paisagens Sem Barcos, de Lauro António (1983); O Fim do Mundo, de João Mário Grilo (1992); Paraíso Perdido, de Alberto Seixas Santos (1995); O Milagre Segundo Salomé, de Mário Barroso (2004).

Ao longo de mais de quarenta anos foi presença assídua na televisão (séries, telefilmes, novelas) sendo de salientar: O Caso Rosenberg (1975), Retalhos da Vida de Um Médico (1979), Uma Cidade como a Nossa (1980),"Origens" (1982) Chuva na Areia (1984), Duarte e Companhia que protagonizou (1985/89), Um Amor feliz (1990), O bando dos quatro (1993), Sim, Sr. Ministro (1996), Alves dos Reis (2000/01), Ajuste de Contas (2000), Ganância (2001), Um Estranho em Casa (2002) e João Semana (2005).

Participou ainda na série Gente Fina É Outra Coisa (série) em 1982 no episódio Cantor de Ópera.

A par da actividade como ator, Rui Mendes trabalhou como cenógrafo e foi, durante duas décadas, professor da Escola Superior de Teatro e Cinema (1980 - 2000).

A 3 de julho de 2020, foi agraciado com o grau de Grande-Oficial da Ordem do Mérito.